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免疫印迹技术

八、转印后切取印迹膜

有时转印后需将印迹剪成较小的片状进行单独处理。单个泳道可以泳动同一样品,待彼此分开后,可用不同的抗体并列检测。如以电泳方向剪膜,就可在同一样品中检测不同分子大小的抗原。为了简便而精确地找到泳道,电泳之后用丽春红S(Ponceaus S)或印度墨汁对印迹膜进行染色,便可很快确定待测蛋白质的位置并将其剪下。表3表明两种染料的适用范围及优缺点,用丽春红S染色的优点是操作简便,价廉和具有可逆性,在封闭过程中,染色易消褪,且不干扰进一步的检测。

在某些情况下,可能想用印迹中的较高分子量区域来检测一种抗原,用另一个区域来检测另一不同分子量的蛋白质。为了使印迹中不同的区域正好对应于相应分子量的范围,这需要在对照泳道中加入已知分子量的蛋白质。这样可方便地在印迹中找到适当的区域并将其剪下。

使用预染的分子量标记,可为转印后切下所需印迹提供良好的指示,此类标记已商品化,但是比丽春红S染色法昂贵。标记中的颜色除了增加成本对实验并无不良影响,而且在泳动时非常漂亮。

表3 用于免疫印迹染色的染料

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印迹膜蛋白染色

[所需试剂]

(1)2%丽春红S浓贮存液(3-羟基-4-[2-磺基-4-硫代-苯偶氮基]-2,7—萘二磺酸):溶于30%三氯醋酸和30%磺基水杨酸中。贮存液可在室温下稳定存放1年以上。

(2)PBS。

[操作步骤]

(1)在染色之前,先配制丽春红S的应用液。即将2%的丽春红S浓贮存液用1%醋酸1:10稀释即成为应用液(注意:如果使用硝酸纤维膜,须将丽春红S应用液更换为用水1:10稀释)。

(2)用丽春红S应用液将PVDF膜洗1次。

(3)加入新鲜稀释的丽春红S应用液,并在室温下搅动5~lOmin。

(4)将PVDF膜放人PBS中漂洗数次,每次1~2min,并更换PBS。

(5)根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记,至此PVDF膜可用于封闭和加入抗体。


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