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免疫印迹技术

五、样本的制备4

免疫沉淀蛋白的样本制备

一般情况下,粗提样品无需进一步纯化即可直接进行凝胶电泳。但下述两种情况在免疫印迹之前,使用免疫沉淀制备蛋白的效果较好。一是含量极稀少蛋白的检测,由于适合凝胶电泳分辨的蛋白质总量有一定限度,通常不可能在凝胶中加入足够量的蛋白质样品来检测含量极稀少的抗原,此时可采用标准的免疫沉淀技术纯化和浓缩待测蛋白;二是免疫沉淀可用来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用,此时,用于免疫沉淀的抗体和免疫印迹的抗体分别针对复合物中的不同蛋白质,如果清楚该复合物的性质,并知道应该使用何种抗体时,这种方法就非常有用,为研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用提供了一种有效的方法。

[试剂与设备]

(1)样品缓冲液。

Tris/Glyeine SDS—PAGE样品缓冲液:2%SDS,100mmol/L DTT(取自—20°C存放的lmoL/L贮存液,临用前加入),60mmol/L Tris(pH6.8),0.01%溴酚蓝和10%甘油

(2)水浴箱。

(3)加样器和吸头等。

[操作步骤]

(1)将样品缓冲液加人吸附有抗原和抗体,并经过洗涤的A蛋白或C蛋白微珠中。使样品缓冲液和微珠的体积比率至少为2:1—5:1左右更好,但一般不超过10:1.

(2)样品置70°C水浴加热至少5min。除特殊情况外,在凝胶内加样之前不必去除微珠。

(3)样品既可立即使用也可冻存。—20°C存放的样品可稳定保存数月。

[注意事项]

(1)对照设置:实验对照的设置应包括能与免疫抗体共沉淀的样品和能与非免疫抗体共沉淀的样品。通过两者比较可以鉴别抗体所形成的特异性条带和非特异性条带(例如,来自于重链的条带)。此外还应该包括含有已知的或标准量的待测抗原的阳性样品,阳性对照可以是含有已知或标准量待测抗原的任何样品,来源于细菌或杆状病毒超常表达系统或来源于已充分鉴定的细胞系。该样品不必经过免疫沉淀但应在临近的胶道和其他样品同时上样电泳。这样能够提示免疫印迹是否成功,并对抗原的相对分子量进行精确比较。如果阳性对照中抗原的量是已知的,可粗略估计待测样品中抗原的含量。

(2)常见问题与解决方法:有一个值得注意的问题,将免疫沉淀制备的蛋白用于免疫印迹时,来自免疫沉淀的抗体会出现在印迹膜上。该抗体可被二抗试剂检出。通常抗体重链和轻链的大小并不干扰待测抗原的鉴定。然而,若待测抗原的大小在50kD或25kD左右(大约为重链和轻链多肽的大小),则难以对待测抗原进行鉴定。出现这种情况,有两种解决办法:一是可将免疫沉淀抗体共价结合在A蛋白或C蛋白微珠上;其二是采用直接检测技术进行测定。


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