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免疫印迹技术

二、样本的制备

几乎任何蛋白质都可用于免疫印迹。免疫印迹的优势是能分析不能用其他的免疫化学技术进行研究的蛋白质样品。例如,不能标记的蛋白质或不溶于温和抽提缓冲液的蛋白质等。免疫印迹还可分析各种组织、器官或微生物等来源的粗制样品。

用于免疫印迹的样本种类繁多,处理的方法也有所不同,为了选择理想的处理方法,应当考虑细胞的类型和待测抗原的性质。

1. 细菌表达蛋白质和样本制备

一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解,具体方法如下:

[试剂与设备]

(1)表达待检测蛋白质的细菌。

(2)50mmoL/LTris-HCl(pH7.4)。

(3)2xSDS凝胶加样缓冲液:

100mmol/L Tris—HCl(pH6.8)

200mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)

4% SDS(电泳级)

0.2% 溴酚蓝

20% 甘油

不含有二硫苏糖醇(DTT)的2XSDS凝胶加样缓冲液可保存于室温,临用前须从1mol/L二硫苏糖醇储存液现用现加于上述缓冲液中。

(4)台式离心机。

(5)超声破碎仪。

(6)水浴箱。

(7)涡漩振荡器。

(8)加样器与吸头等。

[操作步骤]

(1)表达靶蛋白大肠杆菌经诱导适当时间后,用微量离心机以12 000g离心30s,收集1ml培养的菌体。

(2)吸取培养液,加入0.5ml用冰预冷的50mmol/LTris—HCl(pH7.4),振荡沉淀的菌体,使之复悬,用微量离心机于0°C以12000g离心30s回收菌体。

(3)再次吸出上清液,小心地吸净管壁上的液滴,尽可能使沉淀物不带有残留液体。

(4)加入25μl水,振荡使沉淀复悬,一旦菌体分散开来,立即加入25μl 2XSDS凝胶加样缓冲液,继续振荡20s。

(5)样品在沸水浴中放置5min。

(6)采用带有浸入尖头或能在冷却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对DNA进行剪切,根据所用超声处理仪的输出功率及其设定状态,以最大功率处理0.5—2min应能有效地将裂解液粘度降至可控水平;

(7)样品于室温以12000g离心10min,将上清液移至另一管中,弃沉淀物;

(8)吸取经剪切或超声处理的样品25μl电泳,剩余样品保存于—20~C备用。


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