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免疫印迹技术

三、样本的制备2

快速裂解酵母细胞制备样本

使用这种方法会使蛋白质变性,在所用抗体能识别变性靶蛋白时才能使用这一方法。

[试剂与设备]

(1)待检测的酵母菌。

(2)25%三氯乙酸(TCA)

(3)1%SDS。

(4)丙酮。

(5)RIPA缓冲液:

50mmol/L Tris—HCl(pH7.5)

150mmol/L NaCl

1% Nonidet P-40 (NP-40)

0.5% 去氧胆酸钠

0.1% SDS

(6)玻璃珠(直径0.45—0.50mm)。

(7)台式离心机。

(8)水浴箱。

(9)涡漩振荡器。

(10)加样器与吸头等。

[操作步骤]

(1)0°C以12000g离心lmin,从lml培养物中收集细胞,弃上清液(当靶细胞为分泌型蛋白时除外)。

(2)用0.5ml 25%三氯乙酸(TCA)重悬细胞。

(3)按步骤1离心回收细胞,重悬于1ml 90%丙酮中。

(4)按步骤(1)离心,估算沉淀物体积,加入等体积1%SDS重新悬浮沉淀物。

(5)加入经酸处理的玻璃珠(直径0.45—0.50mm)至溶液的弯月面处。

(6)振荡悬液5次,每次间歇期间将悬液置于冰浴中冷却lmin,在相差显微镜下监测细胞

(7)用一烧红的皮下注射器针头(23号)在微量离心管的顶盖上穿一小洞,以防加热过程中玻璃球冲出离心管。

(8)在沸水浴中加热3min。

(9)把玻璃珠转移到另一个微量离心管中,用0.5ml RIPA缓冲液洗涤原离心管,并把洗液合并于内装玻璃珠的管中。

(10)在微量离心管底部打一小洞,回收细胞提取液,这一操作使用烧红的皮下注射器针头效果最佳。把仍装载玻璃球的微量离心管置于另一空微量离心管上,把如此重叠的一对微量离心管,于4°C以2000g离心2min。

(11)回收下面一只内有细胞提取液的微量离心管,于4°C12以2000g离心5min,使提取液澄清,移出上清液置于另一个微量离心管中,—20°C贮存备用。

[注意事项]

酵母细胞提取液储存于—20°C一般是稳定的,但是,如果待测蛋白被水解,则应在提取液中加入蛋白酶抑制剂,并保存于0°C。


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