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免疫印迹技术

四、样本的制备3

哺乳动物细胞和组织的样本制备

哺乳动物细胞和组织有单层培养细胞、悬浮培养细胞和组织碎片,虽然均可采用凝胶加样缓冲液裂解的方法来制备样本,但制备方法有所差异。

这里介绍其中两种方法:

①对单层细胞的处理方法

②对悬浮培养细胞和组织碎片的处理方法

对单层细胞的处理方法

[试剂与设备]

(1)磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

(2)1XSDS凝胶加样缓冲液(参见“细菌表达蛋白质和样本制备”)。

(3)水浴箱。

(4)吸管、细胞刮棒等。

[操作步骤]

(1)用磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗细胞2次,弃去洗液并吸净残余的PBS液体。

(2)如直径为90mm的平皿,则加人100-200μl加热到85°C的1XSDS凝胶加样缓冲液溶解细胞,用细胞刮棒把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中。

对悬浮培养细胞和组织碎片的处理方法

[试剂与设备]

(1)悬浮缓冲液的配制:

0.1mol/L NaCl

0.01mol/L Tris—IICI(pH7.6)

0.001mol/L EDTA(pH 8.0)

1μl/ml Aprotinin

100μg/ml 苯甲基磺酰氟(PMSF)

(2)2XSDS凝胶加样缓冲液(参见“细菌表达蛋白质和样本制备”)。

(3)台式离心机。

(4)吸管或真空抽吸装置。

(5)加样器和吸头等。

[操作步骤]

(1)取1s组织或109细胞,加lml冰预冷的悬浮缓冲液分散细胞或组织碎片(把细胞悬浮于上述缓冲液是为了防止加入2XSDS凝胶加样缓冲液时形成不溶性团块,这一步应使用冰预冷的悬浮缓冲液而且操作应尽可能迅速,以减少蛋白质降解。大多数哺乳动物组织可以在悬浮缓冲液液面之下迅速用镊子分开或用剪刀剪碎。)

(2)于4℃以3000g离心5min,估算离心管底部沉淀物的体积。

(3)吸出上清液,用连接于抽真空装置的一次性使用吸头把管壁上的液滴吸净。

(4)尽快加入等体积的2XSDS凝胶加样缓冲液。

[注意事项]

PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤,吸人、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF,应立即用大量水冲洗之,凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF在水溶液中不稳定,应在临用前从储存液中现加于裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH的升高而加快,且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时,20μmol/L的PMSF水溶液的半寿期大约为35min,PMSF通常配成10mmol/L或100mmoL/L浓度的贮存液(1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中)保存于-20℃。


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