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免疫印迹技术

一、基本原理

免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似,亦被称为Western blot。免疫印迹(western blotting)是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。

典型的印迹实验包括三个步骤:

①蛋白质的电泳分离

②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上,用非特异性,非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域

③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端,极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度,使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。

免疫印迹法原理示意图

免疫印迹

第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷,在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向阳极泳动,分子量越小,泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带)。

第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上,选用低电压(100V)和大电流(1~2A),通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。

第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使区带染色。常用的HRP底物为3,3,—二氨基联苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色)。阳性反应的条带清晰可辨,并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准,确定各组分的分子量。

本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性,是一个有效的分析手段,不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性,并可用于疾病的诊断。在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后,将膜切成小条,配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。


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