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基因芯片技术(一)

基因芯片又称DNA芯片(DNA chip )或DNA微阵列(DNA microarray)。其原理是大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上,然后加入标记的待测样品,进行多元杂交,通过杂交信号的强弱及分布,来分析目的分子的有无、数量及序列,从而获得受检样品的遗传信息。其工作原理与经典的核酸分子杂交如Southern和Northern印迹杂交一致,都是应用已知核酸序列与互补的靶序列杂交,根据杂交信号进行定性与定量分析。经典杂交方法固定的是靶序列,而基因芯片技术固定的是已知探针,因此基因芯片可被理解为一种反向杂交。基因芯片能够同时平行分析数万个基因,进行高通量筛选与检测分析,解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少等不足。

这里介绍的基因芯片是我做过的一个项目,通过点样的方法将探针固定在醛基片上,后与PCR扩增后的产物进行杂交,目的是诊断三个基因位点的点突变。

基因芯片试剂盒的组成一般包括几个方面:

1.PCR扩增体系 从人血液中提取DNA后,用特定的引物对对目的基因进行扩增,在增加目的基因片段量的同时带入可检测的标记信号。

2.杂交体系 将扩增产物与芯片上的探针结合,根据杂交后野生型和突变型结合的信号强弱情况,分析基因组中特定基因的序列。

3.质控体系 成品试剂盒必须带有含有已知基因片段的质控物,在检测的同时监控试剂盒的有效性。

PCR扩增

一、引物设计

引物设计的基本原则:

1.引物与模板的序列要紧密互补;

2.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或者发夹结构;

3.引物不能再模板的非目的位点引发DNA聚合反应,导致错配。

综合来说,引物设计需要考虑的因素有:引物长度(primer length),产物长度(product length),序列Tm 值(melting temperature),引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用∆G 值反映),形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构(duplex formation and hairpin)的能值,在错配位点(false priming site)的引发效率,引物及产物的GC 含量(composition),等等。

由于本试剂涉及到多重PCR的过程,在引物设计上还要考虑不同引物之间相关性的,比如多重引物的Tm值、GC%要相近,各引物之间没有明显的连续错配和结合等,以保证能在同一条件下进行PCR扩增。

现在的引物设计都使用软件进行,著名的有Oligo(下载)、Primer Premier 6(下载)等。设计好引物后即可交给专业公司进行合成,并对其进行标记(如CY3等)。

二、PCR反应体系

PCR反应体系一般包括:

1. 10×扩增缓冲液

2. 超纯dNTP混合物

3. Mg2+

4. 三个引物对

5. ddH2O

6. 模板DNA,即提取的人DNA

7. 热启动 DNA聚合酶(Multi hotstart DNApolymerase)

PCR实验的优化包括:

1.浓度的优化,通过棋盘实验,选择聚合酶、镁离子、各个引物的浓度的最佳组合方案。由于PCR扩增的目的是为了之后的杂交,只和其中一条链杂交,所以可以适当调正向引物和反向引物之间的浓度比,以让效果更佳。

2.反应条件,包括退火温度,扩增时间,循环次数等等。


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