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基因芯片技术(二)

DNA杂交

杂交一般包括基因芯片基片的选择,探针合成,点样以及杂交体系的优化等。

一、基因芯片的基片可分为氨基片和醛基片等。

氨基片主要用于没有氨基修饰的DNA探针,常用来检测基因表达,不需要检测到单个碱基的差异,DNA在其表面固定的化学作用包括静电吸附和共价化合键两种,氨基片的探针和基片结合的效果如下:

氨基片

醛基片适用于长度20-40mer的寡聚核苷酸探针,探针上会带上氨基修饰,如用来检测微生物和miRNA的芯片,这类探针可用来检测单个碱基的不同,提高检测的特异性,探针上的氨基和基片上的醛基是通过发生希夫反应而固定的。醛基片的探针基片集合效果如下:

醛基片

由于我们检测的是单个位点上的突变,所以选择的是醛基片。

探针的设计,根据PCR产物和测定位点,以突变位点为中心进行选择,左右调整,探针之间要无同源性,克多设计几组去合成,最终通过杂交实验,选择特异性强、区分度较高且荧光信号值较高的作为最佳探针。

二、点样

用超纯水溶解探针后,和点样液按比例混合,点样液有防止水分过快挥发、增加粘度、稳定核酸等作用。待混合完整后上点样仪点样,根据要点样的密度和分布设定点样的每个点之间的间距,后仪器操作完成。

对于一个试剂盒,在芯片上需要的点一般包括阴性对照、空白对照、各个位点的野生型探针、突变型探针、标识列、阳性对照以及质控列等,点样时要尽量防止样品间可能的污染,如阳性等留到最后,一避免对前面的点造成影响。

待点样点水分挥发后,2~8℃干燥保存。

三、配制杂交液

杂交液一般含有SSC、SDS、甲酰胺,有些杂交实验的杂交液还有denharhe等试剂,SSC提供杂交所需的盐离子,SSC的浓度越高则杂交所得到的信号越强,同时会增加非特异性错配杂交,降低杂交反应的严谨性,降低杂交背景;甲酰胺是一种变性剂,可以降低杂交的Tm值,通过各个组份浓度的优化,选择对所有产物的杂交效果均表现较好的配比。

四、杂交条件

温度较高可以提高杂交的特异性,但灵敏度可能会下降,时间长也可能会增加非特异性结合,这都需要根据项目的不同情况,去选择合适的温度和时间。

五、同常规的Southem 印迹一样,芯片杂交后也要经过洗涤。洗涤成分及洗涤原则均基本一致,先用lxSSC、0.1% SDS冲洗或漂洗几分钟除去残留的杂交液成分,再降低离子强度除去非特异性杂交,甩去残留在芯片上的液体,室温避光晾干

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