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基因芯片技术(三)

质控体系

质控体系即合成含有已知基因片段的DNA,通过对质控品的检测,可监控整个测试过程是否有效。

质控品包括阳性质控物(野生型核苷酸序列、突变型核苷酸序列)以及阴性对照等。

阳性质控物可以通过使用目的片段构建质粒的方法来大量生成。野生型质粒可以用正常人类基因组DNA进行扩增得到目的产物后,通过连接酶连接至载体上,再传化到感受态大肠杆菌中,大肠杆菌克隆繁殖,这样就可以通过细菌培养来产生大量的目的片段的质粒,从细菌中回收质粒,用于构建所需的质控品。

突变型由于在人群中分布较少,难以通过直接扩增得到,可以引入定点突变的方法,使用正常的人类基因组DNA构建突变型质粒。质粒合成之后,可以对其进行测序确认,筛选中真正符合要求的质粒。

将质粒大致调节至人类基因组的拷贝水平。

注:人类基因组的分子量:1.8*10^12, 1ng 约为3.3444*10^2copies,提取的量一般为:50-100ng/ul,若加入的量为5ul,则拷贝量约为8.36*10^4~1.67*10^5,而质粒一般达到10^10数量级(~100ug/ml)

由于质粒提取过程很容易产生气溶胶,造成污染,所以细菌培养、提取质粒的实验应该和进行PCR实验的区域最好有一定的隔离措施,防止相互污染。


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