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核酸电泳常用缓冲液配制方法(三)

十三、预杂交液/杂交液(RNA杂交用)

20×SSC(或SSPE) 30ml
50×Denhardt’s 10ml
10% SDS 5ml0.5%(w/v)
10 mg/ml Salmon DNA 1ml100g/ml
Formamide(甲酰胺) 50ml50%(v/v)
dH2O 4ml

配制方法:

1.先将上述试剂充分混匀后,0.45μm过滤。

十四、膜转移缓冲液(Western杂交用)

试 剂 名 称 用 量终浓度
去离子水 至1000ml/
Glycine 2.9g39mM
Tris 5.8g48mM
SDS 0.37g0.037%(W/V)

配制方法:

1.先将上述试剂加入约600ml去离子水中,充分搅拌溶解;

2.定容至800mL后,加入200 ml的甲醇,混匀,室温保存。。

十五、TBST Buffer(Western杂交膜清洗液)

试 剂 名 称 用 量终浓度
去离子水 至1000ml/
1 M Tris-HCl(pH8.0) 20ml20mM
NaCl 8.8g150mM

配制方法:

1.先将上述试剂加入约800ml去离子水中,充分搅拌溶解;

2.再加入0.5ml Tween 20,充分混匀,定容至1 L后,4℃保存。。

十六、封闭缓冲液(Western杂交用)

试 剂 名 称 用 量
TBST Buffer 至100ml
脱脂奶粉 5g

配制方法:

1、将上述试剂充分搅拌溶解;

2、4℃保存,现配现用。

十七、Salmon DNA (鲑鱼精DNA 10 mg/ml)

1.称取鲑鱼精DNA 2 g置于500 ml烧杯中,加入约200 ml的TE Buffer。

2.用磁力搅拌器室温搅拌2~4 h,溶解后加入4 ml的5 M NaCl,使其终浓度为0.1 M。

3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。

4.回收水相溶液后,使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20次,以 切断DNA。

5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。

6.离心回收DNA后,溶解于100 ml的去离子水中。测定溶液的OD260值。

7.计算溶液的DNA浓度后,稀释DNA溶液至10 mg/ml。.

8.煮沸10min后,分装成小份(1 ml/份)。-20℃保存。

9.使用前在沸水浴中加热5min后,迅速冰浴冷却。

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