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生物素-亲和素免疫放大技术

五、生物素-亲和素系统的应用

生物素与亲和素间的结合亲和力高、特异性强,且各自均可以与各型大小分子偶联,以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性,生物素-亲和素系统(BAS)被广泛应用于各种生物医学实验方法。随着对生物索和亲和素的立体结构、结合特性和稳定性等的研究不断深入,BAS及其相关技术在多种自动化免疫分析技术领域中的应用,进一步促进了对血浆、体液中一些微量物质如小分子多肽激素、肿瘤标志物、心肌损伤标志物和血药浓度分析等灵敏快速准确测定技术的发展。为免疫检测自动化分析作出了极大的贡献。而且在核酸探针标记;细胞和生物活性物质分离提纯等方面也显示了明显的优越性。

生物素—亲和素系统基本类型及原理

BAS在应用中的基本类型有二种:一类以游离亲和素为中间物,分别连接包含生物素化大分子的待捡反应体系和标记生物素,称为BAB法(biotin-avidin bind.BAB);后来又在此基础上发展了亲和素—生物素化酶复合物技术,称为ABC法(avidin-biotin-peroxidaes complex,ABC)。另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法,或称标记亲和素—生物素法(Labeled-avidin-biotin,LAB)。此外,依据检测反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体,又分为直接法BAS和间接法BAS。下表简示了目前常用的几种BAS的应用实验方法及反应层次。

bas

为最大限度避免待测标本内源性生物素对引入BAS的检测方法的干扰,近年来也依据BAS的基本工作原理,衍生出采用抗生物素抗体或抗亲和素抗体建立相应的BAS:

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BAB法

BAB法也称为桥联亲和素-标记生物素法bridged avidin- biotin technique,BRAB),是以游离的亲和素(或链霉亲和素)作为桥联剂,利用亲和素的多价性,将检测反应体系中抗原。生物素化抗体复合物与标记生物素(如酶标生物素)联结起来,达到检测反应分子的目的。由于生物素化抗体分子上连有多个生物素,因此,最终形成的抗原-生物素化抗体-亲和素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子;加入相应酶作用底物后,即会产生强烈的酶促反应,从而提高检测的灵敏度。间接BAB法则是在抗原与特异性抗体结合反应后,再用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合,使反应增加一个层次,从而使灵敏度进一步提高。

ABC法

ABC法是在BAB法基础上的改良,其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和素)与酶标生物素结合.形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素-过氧化物酶复合物(ABC或SABC)。当其与检测反应体系中的生物素化抗体(直接法)或生物素化第二抗体(间接法)相遇时,ABC(或SABC)中末饱和的亲和素(或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合,使抗原-抗体反应体系与ABC(或SABC)标记体系连成一体进行检测。由于在ABC形成时,一个标记了生物素的酶分子可通过其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素),而一个亲和素,(或链霉亲和紊)分子又可桥联多个酶标生物素分子,经过这种依次的相互作用连接,从而形成一种较大的、具多级放大作用的晶格样网状结构,其中网络了大量酶分子。因此,将ABC或(SABC)复合体应用于免疫检测体系时,即可极大地提高酶在抗原—抗体反应场所的浓度,使该法的检测敏感性明显提高。

BA法

BA(或LAB)法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。该法也有相当高的灵敏度,由于省略了加标记生物素步骤,操作较BAB法简便.间接BA(或LAB)法也是采用生物素化的第二抗体,可以进一步提高检测灵敏度。


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