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生物素-亲和素免疫放大技术

一、生物素-亲和素系统的特点。

生物素-亲和素系统(biotin-avidin system,BAS)是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础,结合二者即可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质,它们的结合迅速、专一、稳定,并具有多级放大效应。 自20世纪70年代,BAS开始应用于免疫化学领域以来,利用BAS可被荧光索、酶、放射性核素等材料标记的特点而发展和建立了许多新的检测方法和技术,尤其是与免疫标记技术的有机结合,极大地提高了测定的灵敏度。目前,BAS技术已在整个生物学领域中得到广泛应用,成为当今生物医学研究工作中最且使用价值和发展前途的技术之一。

生物素(biontin,B)广泛分布于动、植物组织中,常从含量较高的卵黄和肝组织中提取,分子量244.31kD.生物素分子有两个环状结构,其中Ⅰ环为咪唑酮环,是与亲和素结合的主要郎部位;Ⅱ环为噻吩环,C2上有一戊酸侧链,其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构,经化学修饰后,生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素(图1)。亲和素(avidin,AV)亦称抗生物素蛋白、卵白素,是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白,分子量为68kD,等电点pI=10.5;耐热井耐受多种蛋白水解酶的作用.尤其是与生物素结合后,稳定性更好。每个亲和素能结合4个分子的生物素,二者之间的亲和力极强,亲和素常数(K)为10^15 l/mol,比抗原与抗体间的亲和力(K=10^5~10^11 L/mol)至少高1万倍,因此二者的结合特异性高和稳定性好。亲和索以结合1μg生物素所需的量作为其活性单位,1mg纯的亲和素的活性约为13-15U。

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因此,BAS即可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究,亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。BAS在实际应用中所具有的巨大优越性,主要表现在以下几个方面:

一、灵敏度

生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合,形成的生物素衍生物,不仅保持了大分子物质的原有生物活性,而且比恬度高,具多价性。此外,每个亲和素分子有四个生物素结合部位,可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此,BAS具有多级放大作用,使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。

二、特异性

亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力,其反应呈高度专一性。因此,BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时,并不增加非特异性干扰。而且,BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响,使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。

三、稳定性

亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍,二者结合形成复合物的解离常数很小,呈不可逆反应性;而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此,BAS在实际应用中,产物的稳定性高,从而可降低操作误差,提高测定的精确度。

四、适用性

生物素和亲和素均可制成多种衍生物,不仅可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合,用于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素—受体和核酸系统以及其他多种生物学反应体系,而且也可制成亲和介质,用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。此外,多种BAS的商品化试剂,为临床检测和科研工作提供了有利条件。

五、其 他

BAS可依据具体实验方法要求制成多种通用性试剂(如生物素化第二抗体等)适用于不同的反应体系,而且都可高度稀释,用量很少,实验成本低;尤其是BAS与成本高昂的抗原特 异性第一抗体偶联使用,可使后者的用量大幅度减少,节约实验费用.此外,由于生物素与亲和素的结合具高速、高效的特性,尽管BAS的反应层次较多,但所需的温育时间不长,实验往往只需数小时即可完成.

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