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生物素-亲和素免疫放大技术

三、生物素化蛋白质衍生物

(一)生物素化蛋白质衍生物的特性

生物素通过噻吩环戊酸侧链上的羧基与多种大分子偶联活化后,可用于标记各种蛋白质(包括抗体、抗原、酶、激素及葡萄球菌A蛋白等)形成生物素化蛋白质衍生物。而且一个蛋白质分子可联结多个生物素分子,从而使其具较高的比活性,在与亲和素的反应中成为多价。生物素化大分子的多价性,是BAS多级放大作用的物质基础。

生物素化蛋白质衍生物有二类,一种是生物素化的大分子生物活性物质(如抗原、抗体),另一种是标记材料(如酶)结合生物素后制成的标记物。

(二)标记方法

1.标记抗体、抗原 抗体是常用的生物活性大分子物质。由于一个抗体分子可连接多个生物素分子,因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。为适用于不同的抗原-抗体反应体系,通常选用第二抗体进行生物素标记,制备的标记物具通用性。

常用于标记抗体的活化生物素是BNHS。反应时,BNHS分子中的酯键在碱性溶液中迅速水解,C=O基团即可与抗原或抗体蛋白质中的赖氨酸残基形成肽键,使生物素标记在抗体分子上。游离生物素只需简单的透析方法即可除去。

但对于分子偏酸性的抗原,标记时多采用BHZ:

2.标记酶 以生物素标记辣根过氧化物酶(HRP)为例:将含有生物素BNHS的N,N'-二甲基甲酰胺溶液滴加入HRP碳酸盐缓冲液中(0.1mol/L,pH8.4),使最终二反应物混合体积比为1:8,充分反应,然后用PBS透析除去末标记生物素等物质,即得到生物素化HRP。

其他可用于标记的酶有β—半乳糖苷酶(β-Gal)和碱性磷酸酶(AP)。

(三)标记注意事项

1.应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类(氨基、醛基或巯基)以及分子的理化性质(酸性、中性或碱性),选择相应的活化生物素和反应条件。

2.标记反应时,活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例,使每个蛋白质分于上标记的生物素分子数量控制在一定范围,以免影响标记物的活性。如标记抗体时,IgG的应用浓度以0.5—5μg/ml,生物素:IgG的比例(mg/mg)为2:1时.效果较好。一般每个抗原或抗体分子标记1—3或3-5个生物素分子较为适宜。

3.为减少生物素标记蛋白质后,大分于物质造成的空间位阻影响,有利于生物素与亲和素的结合,可在生物索与被标记物间加入交联臂样结构。

4.生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后.不影响后者的免疫活性;标记酶时则结果有不同,对HRP、葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶,酶活性不受偶联生物素的干扰,但某些酶(如碱性磷酸酶)在标记生物素后,其活性会有一定程度降低。


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