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生物素-亲和素免疫放大技术

四、亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记

亲和素及其活性

亲和素在纯水中的溶解度类似于球蛋白.而在50%硫酸铵溶液中的溶解度又与白蛋白相似,亲和素富含的色氨酸与其活性密切相关,是亲和素与生物素咪唑环酮结合的基团。

链霉亲和素及其活性

链霉亲和素(streptavidin,SA)是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质,分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成,其氨基酸组成中,甘氨酸和丙氨酸的含量较大,而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基;链霉亲和素是一种稍偏酸性(pH6.0)的蛋白质,并且不带任何糖基。

链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素,因此与亲和素一样,一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子,二者亲和常数(K)亦为10^15L/mol。在蛋白水解酶作用下,链霉亲和素可在N端10~12和C端19-21间断裂,形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力。链霉亲和素的活性单位也是以结合1μg生物素所需的量来表示,1mg链霉亲和素的最高活性可达18U。

亲和素(或链霉亲和素)的标记

几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素(AV)或链霉亲合素(SA)结合。小分子的有125I、胶体金、荧光素和化学发光物,大分子物质有酶、抗原或抗体、铁蛋白和荧光蛋白等,其中最常用的是酶、异硫氰酸荧光素(FITC)和胶体金。

亲和素或链霉亲和素均为大分子蛋白,其与酶的标记结合物的制备除可用普通酶标记蛋质分子的直接标记法外.由于其特有的与生物素结合的性能,还可以通过与生物素化酶复合物中的生物素结合,间接地与酶形成结合物。

几种制备亲和素(或链霉亲和素)与常用酶形成标记结合物的方法。

(一)亲和素的标记

1.HRP-亲和素结合物的制备

(1)改良过碘酸钠法:新配制的HRP溶液中加入过碘酸钠(NaIO4),将酶分子上的糖基氧化成醛基;依次用醋酸盐溶液(pH4.5-5)和碳酸盐缓冲液(pH9.0)透析,然后在HRP醛基溶液中滴加亲和素搅拌反应,HRP的醛基即可与亲和素的氨基共价结合;加入硼氢化钠(NaBH4)终止反应,再透析、离心去沉淀,上清液即含HRP-AV结合物。

(2)戊二醛法:用新配制的HRP与亲和素溶液充分混匀,加双功能交联剂戊二醛室温反应,后者的二个醛基分别与HRP和亲和素分子中的氨基形成Schiff's,碱使二者连接,经充分透析去掉未反应戊二醛,再离心去沉淀等杂质,收集上清液(含HRP-AV结合物)。

2.亲和素-生物素化HRP复合物的制备:利用亲和素与生物素间特异的结合,将亲和京素与等体积的生物素化酶(HRP-B)按一定浓度比例混合反应后,亲和素即与HRP-B中的生物素结合,形成亲和素—生物素化HRP复合物(avidin-biotin-peroxidase complex,ABC)。

制备ABC复合物时应注意,亲和素和HRP-B的浓度应控制不高于40μg/ml和10μg/ml,否则将增加非特异反应。

3.亲和素-生物素化碱性磷酸酶(avidin-biotinylated—alkaline phosphatase,ABAP)复合物的制备:将亲和素溶液与生物素化AP按4:l(浓度比)比例混合反应(至少十分钟)后即可制得ABAP复合物。

(二)链霉亲和素的标记

链霉亲和索(SA)因表面所带正电荷少,且不含糖基,在实验中的非特异性结合远低于亲和素,因此目前以链霉亲和素标记的酶结合物更为常用。

1.HRP-SA结合物的制备 采用过碘酸钠直接标记:反应在4℃进行,先在HRP中加入NaIO4,然后直接加链霉亲和素溶液混匀,再用碳酸盐缓冲液(PH9.0)透析后,用KBH4终止反应:加饱和硫酸铵沉淀,离心后弃上清液,再用PBS复溶沉淀即得HRP-SA结合物.

2.SA-生物素化HRP复合物的制备 按BNHS标记抗体法制备生物素化HRP( HRP-B),再将HRP-B适当稀释后,加入等体积的链霉亲和素溶液(HRP-B与SA浓度比约1:4)反应,即可制得SA-生物素化酶复合物(streptavidin-biotin-peroxidaes complex,SABC).

3.AP-SA结合物的制备 采用戊二醛二步法:先用饱和硫酸铵沉淀碱性磷酸酶,离心后加过量戊二醛溶液复溶碱性磷酸酶沉诧.戊二醛的一个醛基即与碱性磷酸醇的氨基结合:充分透析除去未结合戊二醛后,加链霉亲和素与结合了碱性磷酸酶的戊二醛另一个醛基结合,用赖氨酸终止反应,离心后留取含AP-SA结合物上清液备用。


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