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1 概述：
依据中国药典二部分要求，进行建立微生物检查法需对细菌、霉菌及酵母菌的计数方法进行验证。
2 原理：
根据不同的样品，将制备成供试液，再将规定量的供试液用薄膜过滤法进行过滤，将滤膜进行培养，对形成的菌落计数，或通过采用平皿法对形成的菌落计数，从而了解供试品的微生物含量。
3 菌种：
大肠埃希菌 [CMCC（B）44102]
金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003]
枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）65301]
白色念珠菌 [CMCC（B）98001]
黑曲霉 [CMCC（B）98003]
4 培养基：
营养琼脂培养基(2010年药典以后,用胰酪大豆琼脂/肉汤替代营养琼脂/肉汤?)
改良马丁琼脂培养基(2010年药典以后,用沙氏葡萄糖琼脂/肉汤替代马丁琼脂/液体培养基。)
5 试剂：
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
0.9%无菌氯化钠溶液
6 设备：
xxx 微膜过滤系统
7 检测方法：
7.1 菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养琼脂培养基中培养37℃培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液将培养物制备成菌悬液，用细菌比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，经梯度10倍稀释至10^5-10^7，约为50-100CFU/ml，供活菌计数及验证试验用。
接种白色念珠菌新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中25-28℃培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液将培养物制备成菌悬液，用细菌比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，经梯度10倍稀释至10^5-10^6，约为50-100CFU/ml，供活菌计数及验证试验用。
接种黑曲霉孢子液至改良马丁琼脂培养基中，经25℃培养5-7天，加入3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸取孢子悬液，用细菌比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，经梯度10倍稀释至10^4，约为50-100CFU/ml，供活菌计数及验证试验用。
7.2 活菌计数
分别取上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌10^5-10^7稀释液各1ml加入平皿，再用不超过45℃的营养琼脂培养基20ml注皿，每个菌株各测定2皿，30-35℃培养48小时，计算菌落数。
分别取上述白色念珠菌10^5-10^6稀释液、黑曲霉10^4稀释液各1ml加入平皿，再用不超过45℃的琥珀红琼脂培养基20ml注皿，每个菌株各测定2皿，23-25℃培养逐日观察计数。
7.3 供试液的制备
取供试品10ml加入到pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml中，混匀后即为1：10供试液。取上述1：10供试液，加入到pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml中，混匀，作为1：100供试液。
7.4 回收率的测定
7.4.1 试验组：取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜，后取1：100供试液100ml、50-100cfu试验菌同时加入滤杯中，抽滤，后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中，共制备两张滤膜，置规定温度培养规定时间，逐日观察结果。
7.4.2 菌液组：取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜，后取灭菌pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml、50-100cfu试验菌同时加入滤杯中，抽滤，后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中，共制备两张滤膜，置规定温度培养规定时间，逐日观察结果。
7.4.3 供试品对照组：取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜，后取1：100供试液100ml加入滤杯中，抽滤，后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中，共制备两张滤膜，置规定温度培养规定时间，逐日观察结果。
8 验证内容、方法及限度：
8.1 设备确认
检查验证所使用的设备的检定状态，并按要求作好记录。
8.2 检查纯化水的细菌、霉菌及酵母菌计数测定的方法验证所需文件。
8.2回收率的计算
8.3 试验限度
经过三次独立的平行试验该供试品接种5株阳性试验菌株，实施薄膜过滤法检查的加菌回收率均不低于70％
欢迎交流。
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