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纯化水细菌、霉菌及酵母菌计数验证方案(示例)

1 概述:

依据中国药典二部分要求,进行建立微生物检查法需对细菌、霉菌及酵母菌的计数方法进行验证。

2 原理:

根据不同的样品,将制备成供试液,再将规定量的供试液用薄膜过滤法进行过滤,将滤膜进行培养,对形成的菌落计数,或通过采用平皿法对形成的菌落计数,从而了解供试品的微生物含量。

3 菌种:

大肠埃希菌 [CMCC(B)44102]

金黄色葡萄球菌 [CMCC(B)26003]

枯草芽孢杆菌 [CMCC(B)65301]

白色念珠菌 [CMCC(B)98001]

黑曲霉 [CMCC(B)98003]

4 培养基:

营养琼脂培养基(2010年药典以后,用胰酪大豆琼脂/肉汤替代营养琼脂/肉汤?)

改良马丁琼脂培养基(2010年药典以后,用沙氏葡萄糖琼脂/肉汤替代马丁琼脂/液体培养基。)

5 试剂:

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液

0.9%无菌氯化钠溶液

6 设备:

xxx 微膜过滤系统

7 检测方法:

7.1 菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养琼脂培养基中培养37℃培养18-24小时,用0.9%无菌氯化钠溶液将培养物制备成菌悬液,用细菌比浊管比浊,其浊度与标准比浊管相当后,经梯度10倍稀释至10^5-10^7,约为50-100CFU/ml,供活菌计数及验证试验用。

接种白色念珠菌新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中25-28℃培养18-24小时,用0.9%无菌氯化钠溶液将培养物制备成菌悬液,用细菌比浊管比浊,其浊度与标准比浊管相当后,经梯度10倍稀释至10^5-10^6,约为50-100CFU/ml,供活菌计数及验证试验用。

接种黑曲霉孢子液至改良马丁琼脂培养基中,经25℃培养5-7天,加入3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,吸取孢子悬液,用细菌比浊管比浊,其浊度与标准比浊管相当后,经梯度10倍稀释至10^4,约为50-100CFU/ml,供活菌计数及验证试验用。

7.2 活菌计数

分别取上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌10^5-10^7稀释液各1ml加入平皿,再用不超过45℃的营养琼脂培养基20ml注皿,每个菌株各测定2皿,30-35℃培养48小时,计算菌落数。

分别取上述白色念珠菌10^5-10^6稀释液、黑曲霉10^4稀释液各1ml加入平皿,再用不超过45℃的琥珀红琼脂培养基20ml注皿,每个菌株各测定2皿,23-25℃培养逐日观察计数。

7.3 供试液的制备

取供试品10ml加入到pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml中,混匀后即为1:10供试液。取上述1:10供试液,加入到pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml中,混匀,作为1:100供试液。

7.4 回收率的测定

7.4.1 试验组:取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜,后取1:100供试液100ml、50-100cfu试验菌同时加入滤杯中,抽滤,后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中,共制备两张滤膜,置规定温度培养规定时间,逐日观察结果。

7.4.2 菌液组:取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜,后取灭菌pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml、50-100cfu试验菌同时加入滤杯中,抽滤,后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中,共制备两张滤膜,置规定温度培养规定时间,逐日观察结果。

7.4.3 供试品对照组:取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜,后取1:100供试液100ml加入滤杯中,抽滤,后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中,共制备两张滤膜,置规定温度培养规定时间,逐日观察结果。

8 验证内容、方法及限度:

8.1 设备确认

检查验证所使用的设备的检定状态,并按要求作好记录。

8.2 检查纯化水的细菌、霉菌及酵母菌计数测定的方法验证所需文件。

8.2回收率的计算

回收率(Rate of recovery)计算公式

8.3 试验限度

经过三次独立的平行试验该供试品接种5株阳性试验菌株,实施薄膜过滤法检查的加菌回收率均不低于70%

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