ATP-2Na注射液无菌检查方法学验证试验记录

检品名称	三磷酸腺苷二钠注射液	检品编号	―	检品批号	070829	规格	2ml：20mg
生产单位	公司				检验数量	2ml/支×45支
供样单位	医院				主检科室	抗生素室
检验依据	《中国药典》2010年版二部附录					温度	25.5℃
收检日期			报告日期			湿度	48％
仪器：自动集菌仪 编号：077018

检品规格

  2ml：20mg

实验材料

1、 培养基：营养肉汤增菌液（批号：050920）；营养琼脂培养基（批号：060215）；玫瑰红那琼脂培养基（批号：060209）；硫乙醇酸盐流体培养基（批号：080220）；改良马丁液体培养基（批号：080121），均来自中检所。

2、 稀释液及冲洗液：0.1％蛋白胨溶液。

3、 菌种：大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941] 、黑曲霉菌[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[ATCC1023]均来自中检所。

4、仪器：自动集菌仪、隔水式或者电热恒温培养箱、低温培养箱、自动高压蒸汽灭菌器等。

实验方法

一、供试品溶液的配制：

取本品15支，用0.1％蛋白胨溶液150ml稀释后摇匀，使药液浓度为：0.13mg/ml。

二、菌液的制备：

1、分别取大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、经35～37℃培养18～24h的营养肉汤培养物1ml，取生孢梭菌[CMCC(B)64941]硫乙醇酸盐流体培养基培养物1ml，加9ml PH7.0Nacl-蛋白胨溶液分别稀释成10-5~10-7菌液，选择10～100cfu/ml的菌液浓度备用。

2、取经23～28℃培养一周的黑曲霉菌[CMCC(F)98003]改良马丁斜面培养物，加PH7.0Nacl-蛋白胨溶液3ml洗下霉菌孢子，取1ml洗脱液，用PH7.0Nacl-蛋白胨溶液稀释成10-4~10-5菌液；取经23～28℃培养24h的白色念珠菌[ATCC1023]改良马丁培养基培养物1ml，用PH7.0Nacl-蛋白胨溶液分别稀释成10-5~10-6菌液，均选择10～100cfu/ml的菌液浓度备用。

三、方法验证――薄膜过滤法：

1、试验组：

取供试品15支，用150ml0.1％蛋白胨溶液稀释后过滤于封闭式滤器（3联筒/套）后用灭菌的0.1％蛋白胨溶液冲洗，细菌部分以300ml/膜，分三次冲洗，（每张膜每次冲洗量为100ml），每筒在最后100ml冲洗液中，分别加入大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各1ml，真菌部分以200ml/膜分2次冲洗（每张膜每次冲洗量为100ml），在最后100ml冲洗液中，分别加入白色念珠菌。黑曲霉菌各1ml，每筒加入一种菌液，所加菌液均为10～100cfu/ml，冲洗液全部过滤后，所有滤筒加相应培养基100ml，置规定温度培养3～5天。

2、菌液组：取上述试验菌液各1ml分别注入与试验组同体积同种类培养基中并置与试验组同条件下培养3～5天。

3、供试品对照组：取供试品15支与试验组相同方法过滤、冲洗，其中2筒分别加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，另一筒加100ml改良马丁培养基后置与试验组同条件下培养3～5天。

4、同时做冲洗液、培养基阴性对照。

四、结果1：

活菌计数结果

  1、细菌计数结果（cfu/ml）

检验时间：06月17日16：00～06月18日 16：00 30～35℃ 24～48h

营养琼脂培养基：批号：050110 产地：中检所 培养箱编号： 075021

	10^-4		10^-5		10^-6		10^-7
实验次数	1	2	1	2	1	2	1	2
金黄色葡萄球菌	0	0	0	0	0	0	62	50
枯草芽孢杆菌	0	0	0	0	17	19	0	0
大肠埃希菌	0	0	0	0	0	0	71	69
生孢梭菌	0	0	52	48	0	0	0	0
铜绿假单胞菌	0	0	0	0	0	0	80	91

真菌计数结果（cfu/ml）

检验时间：06月17日16：00～06月19日16：00 25～28℃ 3～5天

玫瑰红钠琼脂培养基：批号：040929 产地：中检所 培养箱编号：075026

	10^-4		10^-5		10^-6
实验次数	1	2	1	2	1	2
黑曲霉菌	33	36	0	0	0	0
白色念珠菌	0	0	95	86	0	0

五、结果2：

1、 细菌

检验时间：06月18日16：00～06月23日16：00 30～35℃ 3～5天
硫乙醇酸盐流体培养基批号：020903 产地：中检所 培养箱编号： 075024

阳性菌（代数）

检品编号

培养时间（天）

试验组

供试品对照组

菌液组

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

大肠埃希菌4

070829

+

+

+

+

+

-

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-

-

-

+

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+

+

+

金黄色葡萄球菌4

+

+

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+

-

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+

+

+

+

枯草芽孢杆菌4

+

+

+

+

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+

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+

+

+

生孢梭菌4

+

+

+

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+

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+

+

铜绿假单胞菌5

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

阴性对照（培养基）

-

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-

阴性对照（冲洗液）

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-

-

-

2、 霉菌和酵母菌（冲洗量300/膜）

06月18日16：00～06月23日16：00 25～28℃ 3～5天
改良马丁液体培养基批号：020911 产地：中检所 培养箱编号：075068

阳性菌（代数）	检品编号	培养时间（天）
		试验组					供试品对照组					菌液组
		1	2	3	4	5	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5
白色念珠菌4	070829	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	+	+	+	+	+
黑曲霉菌4		+	+	+	+	+	/					+	+	+	+	+
阴性对照（培养基）		-	-	-	-	-	阴性对照（冲洗液）					-	-	-	-	-

注1：金葡稀释至10^7，枯草稀释至10^5，大肠稀释至10^7，铜绿稀释至10^7，生孢稀释至10^5，白色念珠菌[ATCC10231]稀释至10^5,黑曲霉菌[ATCC(F)98003]稀释至10^4.注2：＋为良好生长，—为无菌生长。

六、结论：

根据《中国药典》2005年版二部附录，以薄膜过滤法对本检品进行无菌检查方法学验证，结果以0.1％蛋白胨水溶液为冲洗液时，阴性对照均无菌生长，菌液组阳性对照均生长良好，试验组的大肠埃希菌、生孢梭菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌第一天即生长良好，白色念珠菌和黑曲霉菌，第二天均生长良好，所以本检品的无菌检查可采用薄膜过滤法，取供试品15支用灭菌的0.1％蛋白胨水溶液150ml溶解后，按照薄膜过滤法过滤（3联筒/套），以0.1％无菌蛋白胨水溶液冲洗，细菌部分以300ml/膜为冲洗量，分3次冲洗，真菌部分以200ml/膜为冲洗量，分2次冲洗，每次冲洗量为100ml/膜，阳性对照选择金黄色葡萄球菌。

这是在深圳药检所学习的时候做过的一个验证试验，虽然是关于药品的，和诊断试剂相关性不大，但整个验证方法和诊断试剂的微生物限度检查的验证应该说是大同小异，值得拿来借鉴参考。

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