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免疫印迹扫描判读软件中条带定位技术的探讨

免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。作为免疫分析技术的一大分支,其优点也非常显著:

1.运用抗原抗体反应原理,灵敏度和特异性均表现优异。

2.软膜条完全浸泡在反应液体中,反应充分,所需要的试剂量和样本量均非常少,如样本量一般10ul甚至几微升就可达到要求。

3.高通量,一个膜条可以固定几种、十几种甚至更多的蛋白,用于检测不同的项目,一个检测时间就可以得出多个项目的测试结果。对于疾病的联合诊断、综合判断有很大的优势。

下面谈谈印迹膜条的结果判断。

实验显色过后,一般眼观就可以得出相对准确的结论,但随着技术的发展和高效的要求,也预防一些人为经验等导致的误判,自动扫描判断方面的软件、仪器开发也渐渐增多。现在生产印迹法诊断试剂的厂商也在开发自身配套的判断软件,如欧蒙诊断、HUMAN公司等,他们的判读方法基本上是一致的:首先见测试后的膜条,贴在某一介质(如纸张等)的固定位置上,通过扫描仪扫描,将膜条转化为图像,进入判读软件中,软件对图像进行“切割”,找出膜条并算出反应区的颜色深浅度或者光密度,通过计算,便可以得出检测项目的的检测结果。

整个过程中,膜条定位的准确性就显得格外重要,定位偏差,结果将是谬之千里。在此说说我所使用的一种综合判定处理的方法,位置准确性和对污点的处理均表现良好。

对酶免方面的实验很熟悉的人一般都知道,任何测试0浓度的样本所对应的测试值不会一定就是零,这就存在一个本底的现象,其实很多分析方面的实验都有这样的现象,不管是药物分析、生化、化学发光还是酶免。对于测试值和浓度成正比的模式分析,本底一般都会很低,通过测试多个零浓度的样本得出的精密度必然很高,因为在很低值得情况下,稍微一点点的变动,相对于平均值来说就可能造成很大的波动,这就表现在精密度(CV%)上,平局值越大,变动同样的数值,精密度变化反而变小,比如,本底是0.05,变化幅度是0.01,则变化接近20%,而若本底是0.5,变化幅度仍是0.01,则变化仅为2%,这也就是评价一个试剂盒的精密度指标的时候,不能选择一个太低的值来重复测试算精密度,这样得出的结果没多大的意义,因为自然就已经存在很大的变异(而选择超高值也没多大的意义,因为怎么算,都会很小,除非试剂超差劲),评价试剂盒的精密度一般选择在判定的临界附近或者是某一医学决定水平上,这样就比较客观的反应一个试剂盒的好坏。

将上述原理运用在膜条的定位上面,我们将膜条图像转化成灰度图像,同时为了更符合视觉效应,将图像倒转过来,即白(0)到黑(255),这样就可以把白色当做是本底,那么在未包被有检测蛋白或者测试结果为阴性的局域,显示将是白色的,而此白色绝对不是纯白(0),和上述说法一直,它必定存在着自然的变异,并且由于平均值很低,变异系数相对来说必将是较大的。膜条的图像如下:

免疫印迹膜条|Western blotting membrane

而显色区域,由于是人工或者是机械在上面将均一的液体划线在上面,其均一性要比自然本底的均一性要好。而且,一般的单个膜条都是机械均匀的在20-30cm长的NC上划线,然后切割成4-5mm宽的,这样相对来说就可以认为其纵上看的变异应该是很小的,再者,由于反应出阳性(即显色)的区域,值比较高,相对于本底,纵向的变异系数将是一个较小的值。依照上述方法,加以优化,便可将条带的位置从膜条中定位出来。

定位过程:

1.计算本底值,就是背景值,由于白(0)黑(255),我们可以参照实时荧光定量PCR计算荧光阈值的方法。得出背景值之后,可以先忽略背景值一下的区域(可认定都是阴性的区域,我们重点还是关注阳性的区域)。

2.找出参考线或者功能质控带,参考线是人为划上去颜色很深的条带,是必定存在、未实验前就可看到的,功能质控带是反应后理论必将出现的,颜色一般也较深,利于定位,在图像的前端一定区域内搜索,找出这两条带的其中一条,便可算出膜条在图像中的实际分布概况和相对于软件上定位参数的偏移。两条带还可以相互印证,为下一步寻找测试条带算出最佳方案。

3.通过参考线/功能质控带,在根据纵向的精密度、纵向的平均值、印迹膜条的定位参数等多个信息,找出阳性区域条带的位置和测试值(或光密度)


4.得出参考线、功能质控带、判断指示带、阳性条带的坐标或测试值后,再根据这些值的相应关系,算出阴性条带的坐标和测试值。(但简单点说,阴性的结果还用去算吗?)

图解:

从上图克看出,在阳性显色条带出,均出现了精密度下降的一个波谷(绿色圈点),而在干扰的部分,虽然其值也很高,但是变异系数也会很大,与正常的条带可以区分开来(如上图红圈圈出,其对应的位置是条带编号数字)对于条带中的不规则污点也可以用这种方法区分开,这样就可以达到准确定位条带位置的目的。

测试结果展示:

免疫印迹定位软件,Western blotting software
免疫印迹定位软件,Western blotting software
免疫印迹定位软件,Western blotting software
免疫印迹定位软件,Western blotting software

从上述结果看基本达到了定位的目的,准确性和抗干扰能力都很好。

当然,定位的准确性还有赖于软件对目标图像的“切割”上,若图像倾斜过多,或“切割”不理想,定位的结果也不会很理想。现在不管是欧蒙还是HUMAN。都是将测试完的膜条平行地贴在划有线条的纸片上,然后扫描,然后在软件中对固定区域切割,得出目的的膜条图像。

另一设想,如果不同项目的膜条在膜条的前端使用不同的颜色标记,那么扫描到软件后,软件通过识别前端的颜色,就可以自动识别到测试的项目,然后直接调用相关的参数进行运算,这样岂不是每个测试连项目是什么都不用输入了,最多确认一下试剂盒的批号,很快就可以得出测试的结果,相当高效。

由于软件只是一个模块,没实用价值,就不再提供下载地址。

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