菌种保藏及日常管理

一、 菌种保藏：

微生物是具有生命活力的生物体，其每一代生存的时间一般很短，容易在传代过程中发生变异甚至死亡。

菌种保藏的中心任务是广泛收集各种有用的微生物菌种，选择最适宜的保藏方法，避免在保藏和传代过程中死亡、变异、衰退以及活力减弱，以保持菌种原由的各种生物学特性，从而达到保证研究、检验、交换和使用要求的目的。

菌种保藏是药品微生物检验和无菌检查工作中的一项常规技术，菌种的科学保藏和管理直接关系到检验结果的正确性。

菌种保藏机构：中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）于1979年成立。下设7个菌种保藏管理中心，其中医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）有三个单位组成：中国医学科学院皮肤病研究所――真菌宝藏，中国药品生物制品检定所――细菌保藏，中国医学科学院病毒研究所――病毒种保藏。世界菌种保藏联合会（WFCC），国际机构，我国为成员之一。美国标准菌种收藏所（ATCC）创立于1899年，位于美国马里兰州罗克韦尔市。

常用菌种保藏方法：

菌种保藏的原则：根据微生物菌种的生理、生化特性，在人工创造的条件价尽量降低微生物细胞的代谢强度，是细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。

低温、干燥。缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁殖，因此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手段。

保藏方法		保藏状态	适用范围	保藏时间	保藏特点
液氮超低温保藏法		超低温－196℃	广泛	数十年	复杂、需要专门设备，有效
冷冻真空干燥保藏法		干燥、缺氧、低温	广泛	5～10年以上	复杂、需要专门设备，有效
干燥（沙土、牛奶）保藏法		干燥、无营养	产孢微生物	1～10年	较简便、需制备沙土管，有效
液体石蜡保藏法		低温、缺氧	广泛	1年以上	简便
琼脂斜面低温保藏法		低温-4℃	广泛	1～6个月	简便
液体冷冻保藏法	液体培养基	低温	广泛	半年以上	简便
	一定比例甘油	低温、缺氧	广泛	半年以上	简便
瓷珠冷冻保藏法		低温	广泛	一年以上	简便

琼脂斜面低温保藏法:

菌种	培养基	保存温度	传代时间
细菌	一般为营养琼脂斜面或根据菌种规定选用	4～6℃	芽孢菌3～6个月，其他细菌1个月
酵母菌	霉菌琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂斜面	4～6℃	一般3～6个月
真菌	PDA琼脂或改良马丁琼脂斜面	4～6℃	一般3～6个月

一些常用标准菌种的琼脂斜面低温保藏法：

菌种	培养基	保存温度	传代时间
金黄色葡萄球菌	营养琼脂斜面培养基	4℃	1个月
大肠埃希菌
乙型副伤寒沙门菌
枯草芽孢杆菌
铜绿假单胞菌		室温
生孢梭菌	疱肉培养基	4℃	3个月
白色念珠菌	改良马丁琼脂斜面培养基
黑曲霉

液体冷冻保藏法：

菌种	保存液（2ml）		保存温度	保存时间
金黄色葡萄球菌	营养肉汤	10％～40％甘油	－18～－80℃	半年以上
大肠埃希菌
乙型副伤寒沙门菌	胆盐乳糖增菌液
枯草芽孢杆菌
铜绿假单胞菌
生孢梭菌	疱肉培养基
白色念珠菌	改良马丁琼脂斜面培养基
黑曲霉

二、菌种的传代和使用：

细菌的接种、分离和培养：接种、分离和培养是微生物学实验的基本操作技术，要求在无菌操作和/或无菌环境下进行，

接种：将微生物的培养物。含有微生物或可以污染有微生物的样品接种到培养基上的一种操作技术。

培养基种类：

斜面培养基：主要用于纯菌，使其增殖后用于鉴定或者保存。

半固体培养基：主要用于观察细菌的动力或者保存菌种。

液体培养基：主要用于增菌、无菌检查、生化实验等。

平板培养基：主要用于细菌分离、菌落形态观察、药敏实验等。

接种方法：涂布法、划线法、穿刺法、加入法等。

分离：未来获得纯菌种（株）采用的将细菌分离成单个细胞，事情独立分裂繁殖形成单个菌落的操作技术。分离一般采用平板培养基，分离方法主要有分段划线法、连续划线法、涂布法、倾注分离法等。

培养：接种后的培养基，根据不同微生物生长条件的要求，将培养基放在适宜微生物生长的环境中（温度、湿度、氧气等），使其生长繁殖的过程。

需氧培养法：适用于需氧菌和兼性厌氧菌的培养，采用普通培养箱或低温培养箱。

厌氧培养法：用于厌氧菌的培养，采用厌氧培养箱、培养袋（盒）等。

培养后微生物的生长现象：

固体培养基：有菌落生长或者沿穿刺线扩散生长。

液体培养基：有浑浊、菌膜、沉淀等现象。

菌液的制备：斜面培养物一环→适宜的液体培养基10～15ml，培养18～24h→取适当量，用灭菌生理盐水稀释后比浊→按说明和预实验将菌液稀释到相应倍数→计数、验证实验、阳性对照。

菌种的传代过程图：

菌种传代的简易操作过程：

取出冻干菌种安瓿瓶，消毒后在酒精灯外火焰烧前端，再滴加培养基致使瓶前端爆裂，再用无菌纱布包出掰断，用灭菌细吸管吸少许培养基入瓶中混匀，再吸出，加入培养基中培养，得出的为第1代，第1代菌可以接种至斜面培养基中，亦可以继续接种至肉汤中（厌氧菌为疱肉肉汤，即肉汤中加入少许牛肉干碴），第2代菌液可吸入冻存管中，1ml/管，－20℃冻存。5.22传了个生孢（从1代），转入两只50ml的硫乙醇液体培养基中，用吸管吸约1ml入50ml培养基的底部，并用接种环接中至疱肉肉汤中。做大肠、金葡、绿浓、沙门菌的传代（从2代到3代）从2代的斜面中再接种至四支营养琼脂斜面中，并从2代斜面传入肉汤中。得到四支斜面和一支肉汤的第三代菌种。

控制菌种的衰退方法：

1、 控制传代次数：尽量避免不必要的接种和传代，降低突变几率，采用良好的传代保藏方法。《中国药典》2005年规定，传代次数不超过5代。

2、 创造适宜的培养条件，提供适合原菌生长繁殖的各种条件，是防止菌种衰退或变异的有效措施。

3、 用不同类型的细胞进行传代，如放线菌和丝状真菌一般用孢子接种传代比菌丝体稳定。

4、 采用有效的保藏方法，根据不同菌种的特性，选择适宜的保藏方法。

三、菌种的日常管理

菌种应由专人保管，管理人员具有微生物专业知识和技术水平，瓶应具有较强的责任心。

菌种应冷藏或者冷冻保存，保存菌种的冰箱不得放置食品和易挥性药品（专门冰箱，上锁保管）。

应由专人按操作规程和有关要求定期惊醒传代，并定期对保存的 菌种进行检查，一般每年1～2次，发现异常情况应及时检查，一旦发现菌种污染和变异现象，应立即报告、研究处理、尤其长期保存时。

菌种的来源、传代、分离复壮、使用和鉴定等均应该做好详细记录。包括菌种时间、名称、菌号、代数、保存方式、分离复壮方式、使用内容、鉴定情况等。

菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购买应有登记，并包装严密。

菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有详细记录。

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